——声明：仅供医疗专业人士参考
编者按
随着精准医疗的发展，肺癌驱动突变的基因检测和靶向治疗也得到了长足进步，然而这都是基于对肿瘤的组织活检。虽然组织活检作为肿瘤诊断的“金标准”，但是由于组织活检具有侵入性、肿瘤组织重复获取困难且具有异质性，限制了其在临床上的应用。液体活检作为精准医疗新技术，恰好弥补了这一缺陷，以容易获取样本、创伤性小、重复性高、不受肿瘤异质性影响等特点，在肺癌诊疗中的应用日益广泛。为此，智慧病理网邀请医院病理科刘慧主任为大家详细介绍液体活检在肺癌中的临床应用价值。
刘慧博士，主任医师、副教授，硕士生导师徐州医科大学病理学教研室主任医院病理科主任江苏省抗癌协会肿瘤病理专业委员会副主任委员江苏省医师协会病理科医师分会副会长中华医学会病理学分会淋巴造血疾病学组委员中华医学会病理学分会分子学组委员中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会淋巴造血疾病学组委员中华医学会病理学分会第一届中青年病理科主任工作委员会委员中国医疗保健国际交流促进会病理学分医院学会超微与分子病理专业委员会分子诊断医院学会超微与分子病理专业委员会神经系统疾病多学科诊断专业组委员液体活检——肺癌患者的临床常规管理中的“新辅助”
肺癌是导致全球癌症相关发病率和死亡率上升的主要原因，早期诊断率仅为15%，约75%的患者确诊时已处于局部晚期或转移阶段[1]。临床究竟该如何躲避肺癌杀手？早期发现才是良策！在肿瘤的诊疗过程中，传统的诊断技术有一定的局限性，如影像学和组织活检，前者具有滞后性，往往会让患者错过最佳治疗时间，后者不仅是一种有创的检测手段，而且不能进行实时监测。液体活检（LiquidBiopsy）是一种非侵入性的新型诊断技术，通过血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断。液体活检主要检测体液中的游离循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）、循环肿瘤DNA（CirculatingtumorDNA，ctDNA）和外泌体（Exosome）等生物标志物，已经成为肺癌患者的临床常规管理中的“新辅助”。本文就液体活检技术在肺癌诊断、疗效检测、预后评估、个体化用药指导和突变检测中的应用以及液体活检目前面临的挑战作一介绍，以期为肺癌的精准医疗提供更好的参考。
组织活检和液体活检的优缺点
1.液体活检技术
液体活检作为体外诊断的一个分支，是指通过检验血液，或者尿液、唾液、胸腔积液等其他体液中的生物标志物，对癌症做出分析诊断。基于血液的液态活检是目前最主要的研究方向，主要检测血液中的CTC、ctDNA和外泌体等。
?1.1CTC的概念及检测方法
CTC是指由原发肿瘤和/或转移灶脱落并进入血液循环的肿瘤细胞。CTC与其他血细胞的区别在于其表达，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）和细胞角蛋白（CK），低表达白细胞特异性标记CD45[2]。外周血中的CTC含量极低[1~10CTC/(血细胞·mL血)]，因此，CTC需要极其灵敏和特异的分离和检测方法。CTC检测技术可分为细胞计数的检测方法和以核酸为基础的检测技术，其过程大致可以分为细胞的富集以及细胞的检测，现有的检测技术有流式细胞术、密度梯度离心、靶向PCR技术、CTCs芯片、上皮细胞免疫斑点法、CellSearch等[4]。研究发现，使用单一的技术来检测CTCs，很可能出现漏检的情况。所以，各种方法联合应用提高敏感度和特异性将成为检测CTCs的趋势。
?1.2ctDNA的概念及检测方法
ctDNA是一种由肿瘤原发灶（继发灶）释放入血的肿瘤DNA，携带肿瘤组织的基因突变信息。目前认为，ctDNA主要来自血液中坏死、凋亡的肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外排体。研究显示，肿瘤患者ctDNA所携带的肿瘤突变信息与肿瘤组织具有良好的一致性。由于血液中的ctDNA含量低，绝大部分＜1%，所以对于ctDNA的检测也需要有较高的敏感性。目前，ctDNA常用的检测技术有数字PCR和二代测序技术[2]。
?1.3外泌体的概念及检测方法
外泌体是细胞主动向胞外分泌的囊泡样小体，直径在30~nm之间，可在血液、尿液、脑脊液、胸膜积液等多种体液中检测到，其携带有母细胞多种蛋白质、脂类、DNA和ＲNA等重要信息，在细胞和细胞间的物质交换和信息传递起到重要作用[4]。NSCLC患者的Exosomes中包含的肿瘤相关蛋白有EGFR、KRAS、claudins、RAB家族蛋白等。HuangHS等[5]分离出了NSCLC和肺部慢性炎症患者的Exosomes并对其进行蛋白分析比较，从80%的NSCLC患者Exosomes表面检测到了EGFR，而肺部慢性炎症患者的检出率仅为2%。目前，分离外泌体的方法主要有超速离心、密度梯度离心、免疫磁珠、微流控芯片等[6]，RT-PCR、核酸测序、WesternBlot等可被用来鉴定外泌体RNA和蛋白质水平。
2.液体活检在肺癌患者的应用
?2.1早期辅助诊断
Ilie等[7]报道在怀疑为肺癌的COPD患者中检测到CTC。在本研究中，每年对COPD患者进行低剂量螺旋CT筛查，其中约3%（5例/例）COPD患者中CTC呈阳性，但CT结果正常。接着对这五位患者进行跟踪监测，在CTC检测后1到4年即发现肺结节，手术切除后经组织学诊断为早期肺癌。一项分析早期NSCLC患者ctDNA谱的研究表明，除了在12例患者中ctDNA检测到一个单核苷酸变异(SNV)，有46例的患者（48%）检测到至少有两个单核苷酸变异，这表明，ctDNA谱可用于早期肺癌的筛查[2]。
?2.2疗效监测
研究表明，CTC的计数与NSCLC患者帕尼单抗和厄洛替尼临床疗效呈正相关，可预测靶向药物的疗效。当CTC≥1时，NSCLC患者治疗效果不佳；当CTC＜1时，NSCLC患者治疗效果较好[8]，表明通过治疗过程中CTC的动态监测可以用来帮助判断患者疗效。多项研究发现ctDNA变化与治疗效果和预后显著相关。Xing等[9]分析了36例肺腺癌患者使用奥希替尼治疗前后的ctDNA样本的体细胞突变谱，发现ctDNA变化与治疗效果和预后显著相关。
?2.3预后评估
肺癌患者中CTC与不良预后相关。对于早期肺癌患者，术前检测到的CTC数量越多，则肿瘤的无进展生存期及总生存期越短。Krebs等报道，CTC＜5的患者PFS为6.8个月，显著高于CTC≥5的患者（PFS为2.4个月）[2]。研究表明，对于肺癌患者来说，miRNA-、miRNA-30d的水平升高及miR-1、miRNA-的下降均是预后较差的指标[10]。
?2.4个体化用药指导和突变检测
目前，液体活检技术用于非小细胞肺癌EGFR-TKI继发耐药的监测时，更多检测的是ctDNA。中国国家食品药品监督管理总局（CFDA）于年2月批准吉非替尼说明书更新，更新后的说明书指出在肿瘤组织不可评估时，可通过血液ctDNA标本评估EGFR突变状态，指导吉非替尼治疗[11]。外泌体miR-21通过下调PTEN和PDCD4，激活PI3K/Akt通路，参与NSCLC患者EGFR-TKI获得性耐药的发生[12]。通过测定血浆ctDNA中的MET基因拷贝数，预测肺癌患者EGFR-TKI治疗的反应[13]。
CTCs和ctDNA的临床应用示意图
3.液态活检目前面临的挑战
然而，与传统的组织活检相比，虽然液体活检优势诸多，但也面临多个挑战。其一，血液中CTC和ctDNA的含量极微，这就需要不断革新技术来增加仪器检测的灵敏度和特异性。其二，血浆中CTC和ctDNA代表的是所有肿瘤的克隆灶，还是某一种占优势肿瘤的克隆灶目前尚不清晰，有待进一步研究。其三，经济方面，新技术导致高价格，限制了临床开展，期待未来随着成本降低、试剂耗材国产化等使经济问题得以改善。其四，为了使液体活检更好的应用于临床，不仅需要扩大临床试验规模，还需要建立相应的检测标准，建设规范的监管体系。
4.小结
液体活检以其标本获取简便、创伤小、重复性高的特点在近年来引起了广泛